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2× Super EvaGreen ® Master Mix for HRM
2x Super EvaGreen ® Master Mix for HRM 是一款用于实时定量 PCR 和高分辨率溶解曲线分析的专业试剂盒。
- 描述
描述
产品名称：2× Super EvaGreen ® Master Mix for HRM
产品货号：S2013
产品规格：100T，500T
产品内容
| 组分 | 100T | 500T |
| A. 2 ×Master Mix | 1 mL | 5×1 mL |
| B. 10 × ROX reference dye | 0.5 mL | 1 mL |
组分 A 包含 Super EvaGreen ® dye，dNTP，PCR buffer（含Tris 和 MgCl 2 ），热启动 Taq 聚合酶；组分 B 是 10 ×ROX 参照物。
产品参数
λabs/λem = 500/530 nm (结合 DNA)
λabs = 471 nm (未结合 DNA)
储存条件
-20℃避光保存，推荐条件下至少可以储存 6 个月以上。使用前，将产品室温下解冻，并轻轻涡旋混匀，解冻后所有实验应在冰上操作。使用后，该产品可以重新冷冻储存。
产品介绍
2x Super EvaGreen ® Master Mix for HRM 是一款用于实时定量 PCR 和高分辨率溶解曲线分析的专业试剂盒。其中 Super EvaGreen ® 是一种新型的专为 qPCR 和高分辨率溶解曲线分析设计的 DNA 结合染料，它通过一种“按需求释放”的机制，极大地降低了对 PCR 扩增的抑制性，可使双链PCR 产物的结合量达到饱和状态，所以称为“饱和染料”，不会产生 SYBR Green 的染料重排现象，能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异 Super EvaGreen ® 的另一个优点是它的安全性。
本产品包含一种高保真的热启动 Taq DNA 聚合酶，该酶经过化学修饰，常温下没有活性，可避免非特异性产物的扩增。本试剂盒可用于已知 SNP 分析，未知突变基因扫描
和甲基化检测等。
Super EvaGreen ® 的突出优点是它的安全性。常规 DNA结合染料存在潜在致突变性。我们研发的 Super EvaGreen ®染料，不能透过细胞膜，因而不能与活细胞的基因组 DNA结合，确保了其安全性。然而，其他所有的商业性 PCR 荧光染料都可以在几分钟内进入细胞，如 SYBR Green I，是种众所周知的环境毒性比溴化乙锭（EB）还要大的诱变剂。
使用方法
1. 取出 2×Super EvaGreen ® Master Mix for HRM, 引物，模板，RNase-free 水，恢复至室温，轻轻涡旋，充分混匀。
2. 按照如下体系制备反应混合液：
| 反应组分 | 20 μL 反应体系 | 终浓度 |
| 2×Super EvaGreen ® | 10μ L | 1× |
| F, R 引物 | 2 μL | 各 0.1-0.5 μM |
| 模板 | 适量 | 见注 1 |
| 10× ROX | 适量 | 见表 1 |
| H 2 O | 补足至 20 μL |
注意事项：
1. 模板浓度：DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA 作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
3. 轻轻涡旋混匀反应混合液，转移固定体积至 PCR 管。
4. 运行 PCR 程序，PCR 程序设置，参考第二页。
反应程序设置
您可以根据扩增模板的性质和仪器的功能，选择以下三个程序之一进行实验。
A ．两步快速扩增法
这个程序适用于大多数引物 Tm 为 60℃的扩增，溶解曲线遵循您所用仪器提供的标准流程执行。
| 程序 | 温度 | 时间 | 循环 |
| 酶激活 | 95 ℃ | 2 min | 1 |
| 变性 退火&延伸 | 95 ℃ 60 ℃ | 5 s（ 见注 1） 30 s | 45 |
注意事项
1）变性时间：如果扩增片段较短，变性时间可以低于 5 s，甚至可以低至 0 s。当变性时间设置为“0”时，它仅仅意味着温度增加到 96 ℃，然后没有停留迅速降温。设置时间 5 s可以确保 DNA 较长片段和高 GC 片段的变性。高性能的仪器会进一步增加扩增子变性的可靠性。
B . 三步扩增法
这个程序适用于扩增温度比退火温度高的实验。例如，如果扩增片段有相对较长的引物，容易产生非特异性的扩增，在更高的温度下进行延伸可以降低非特异性扩增。溶解曲线遵循您所用仪器提供的标准流程执行。
| 程序 | 温度 | 时间 | 循环 |
| 酶激活 | 95 ℃ | 2 min | 1 |
| 变性 退火 延伸 | 95 ℃ 50-60 ℃ 72 ℃ | 5s | 45 |
| 5 s（ 见注 2） | |||
| 25 s（ 见注3） |
注意事项
2）退火温度：退火温度应根据引物 Tm 值设定，通常是 5-60 ℃为佳。不过，引物 Tm 值（和扩增温度）应该设计尽可能地接近 60 ℃（但仍在 50 – 60 ℃范围内），减少退火和变性温度之间的差距。这样温度增加所需时间更少，进而扩增效率更高。
3）扩增温度：扩增温度设定在 72 ℃对于大多数扩增子通常效率更高。然而对于富含 AT 的扩增片段（> 70%）或含有AT 富集补丁的扩增子，60 ℃延长通常可以获得更好的结果。
C ．通用程序
此程序适用于几乎所有 qPCR 仪器，也适用于使用快速扩增法无法达到较好效果的扩增子。
| 程序 | 温度 | 时间 | 循环 |
| 酶激活 | 95 ℃ | 5 min | 1 |
| 变性 退火&延伸 | 95 ℃ 60 ℃ | 15 s 60 s | 45 |
Super EvaGreen ® 染料特性
光谱特性
图 1. 在 TE 缓冲液中，结合到双链 DNA 中的 Super
EvaGreen ® 染料的激发光谱（左图）和发射光谱（右图）。
SYBR Green I 与Super EvaGreen ® 荧光染料的稳定性比较
图 2. Super EvaGreen ® 、SYBR Green I 的吸收光谱 1.2uM,
pH 9 的 Tris 缓冲液中，99℃孵育 3 h 后，两种荧光染料溶液
的相对荧光强度，ROX 作参照物。
Super EvaGreen ® 染料特性
染料的稳定性
Ames 实验显示，Super EvaGreen ® 染料没有细胞毒性和致突变性，该染料不具细胞膜渗透性（图 3），这是其低细胞毒性的一个关键因素。相反地，众所周知，SYBR Green I 荧光染料具有很强的致突变性，可能原因是其抑制了细胞内 DNA 修复机制（Ohta, etel. Mutat. Res.492, 91(2001)），而 SYBR Green I 较强的细胞毒性是由其较高的细胞膜渗透性所导致的（图 3）。
Super EvaGreen ® 、SYBR Green I 荧光染料细胞膜渗透性比较
图 3. 37℃条件下，用 SYBR Green I 或 Super EvaGreen ® （1.2uM）孵育 HeLa 细胞，分别在 5 min 或 30 min 后拍照，观察荧 光强度。SYBR Green I 迅速渗透进入细胞，然而 Super EvaGreen ® 几乎不具有细胞膜渗透性。
表 表 1 、根据 PCR 仪种类不同，推荐 ROX
PCR Instrument | 推荐 ROX 使用浓度 | 使用量 （20uL 体系） |
BioRad: iCycler, MyiQ, MiQ 2, iQ 5, CFX-96, | No ROX | None |
ABI: 7500, 7500 Fast, ViiA 7 Stratagene: MX4000P, MX3000P, MX3005P, QuantStudio, Illumina Eco, Thmorgan Q6,Q4 | Low ROX 0.05~0.1× (终浓度) | 按 1:10 稀释 10×ROX； 添加 1~2uL 稀释后的 1×ROX 至最终反应体系 |
| ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOne plus | High ROX 1×(终浓度） | 添加 2uL 10×ROX 至最终 反应体系 |
