Super EvaGreen ® , 20×

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Super EvaGreen ® , 20×

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Super EvaGreen ® 是一种用于实时定量 PCR(qPCR)的 DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于 SYBR Green I。

SKU: S2007 分类:
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描述

产品名称:Super EvaGreen ® , 20× 水溶液
产品货号:S2007
产品规格:1 mL,5mL
应用范围:实时定量 PCR、高分辨率溶解曲线
产品参数
λabs/λem = 500/530 nm (结合 DNA)
λabs = 471 nm (未结合 DNA)
储存条件
4℃或-20℃,避光保存,有效期 1 年。
产品 介绍
Super EvaGreen ® 是一种用于实时定量 PCR(qPCR)的 DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于 SYBRGreen I。除了有相似的光谱特性,Super EvaGreen 有三个主要特点使它区别于 SYBR Green I 。
首先,Super EvaGreen ® 对 PCR 的抑制性远小于 SYBR Green I。因此,使用 Super EvaGreen ® 进行的 qPCR 实验可以使用快速 PCR 步骤。同时,Super EvaGreen ® 在实验中可以使用较高的浓度,从而获得远强于 SYBR Green I 扩增信号。较高浓度的 Super EvaGreen ® 也消除了“染料重分布”的缺陷,使 Super EvaGreen ® 既可用于多重 PCR,也可用于高分辨率(高清晰)溶解曲线分析(HRM)。该分析正被越来越多的用于PCR 后的基因分型和异源双链分析。由于 SYBR Green I 对 PCR 的抑制性,从而要求其使用浓度必须很低,因此 SYBR Green I 无法解决由低浓度造成的染料重分布问题,既不能用于多重 PCR 也不能用于 HRM。同时,染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性,因为低熔点的DNA 链可能由于这种原因而无法检测到。
第二,Super EvaGreen ® 的稳定性极强。在正常的储存、操作和 PCR 过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里,也可以反复冻融。与之相反,SYBR Green I 不稳定而且降解后对 PCR 抑制性更强。
第三,Super EvaGreen ® 降低了细胞膜透性,因而比SYBR Green 1 更加安全。独立实验室的测试结果显示,Super EvaGreen ® 既没有诱变性也没有细胞毒性。相反,虽然 SYBRGreen I 本身诱变性很弱,但它在细胞中可能抑制了正常DNA 的修复机制,使其有诱变增强作用。考虑到 PCR 的广泛使用,其安全性应该足够重视。
使用方法
1. 如下建立实验体系:(仅供参考)

名  称体  积
10× 的无镁离子聚合酶缓冲液5 µL
50 mM MgCl 22.5 µL
2 mM dNTP5 µL
20×Super EvaGreen ®2.5 µL
Taq DNA polymerase1-5 units
F, R Primers各 0.1-0.5 µM
模板适量
dH 2 Oto a final volume of 50 µL


主要试剂

实时定量 PCR 检测 20× Super EvaGreen ®实验目的
注:DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类
的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行
梯度稀释,确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA 作为模板
时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
2. 执行实时定量 PCR 程序,采集荧光信号。

1. Prime
hβ-actin:
forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)
3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)
4. BSA: Sigma(A7030)
5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)

实验方案
1. 配制 2× Super EvaGreen ® Buffer

2×Super EvaGreen ® Buffer

组分

浓度

体积(μL)

1 M Tris HCl pH8.5

50 mM5

500 mM (NH4) 2 SO 4

20 mM

4

50 mM MgCl 27 mM

14

50% glycerol

2.5%5
DMSO

10 %

10

20× Super EvaGreen ® Buffer

10

10 mM dNTPs0.4 mM

4

2 % Tween20

0.03 %

1.5

1 mg/mL BSA

22

2.2

H 2 O

44.3

Total volume

100

2. 配制 q-PCR 反应体系

成分20 μL/ 体系/ 管反应
 10 μM primers1μL
模板适量
HS Taq DNA 酶 (5 U/μL)0.2 μL
2× Super EvaGreen ® buffer10  μL
H 2 O定容至 20 μL

注:a. DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA 作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。

b. 引物终浓度一般控制在 0.1-0.5μM 范围内。

3. 实验分组:标准对照样品孔(阳性对照)、检测样品孔、空白对照孔(阴性对照)共三组,同时进行检测,分别进行三次平行实验。
4. 混匀离心、上机进行荧光定量 PCR(仪器为 Roche:LC96)。
PCR 程序:

温度时间
 95 ℃2 min
95 ℃5 sec
60 ℃30 sec
重复 2~3,共 45 个循环
溶解曲线 57 ℃~99 ℃

5. 保存数据,判断样本质量:
A.检测样品与标准品之间的 Ct 值差
B.检测样品与标准品之间的荧光强度差
检测结果需达到:以上两组检测指标无显著性差异。